（作者： 黃龍縣農(nóng)業(yè)綜合執(zhí)法大隊 王利）

摘要：為建立甘藍(lán)型油菜高效離體再生體系，以6個甘藍(lán)型油菜品種的子葉和下胚軸為外植體，研究基本培養(yǎng)基、預(yù)培養(yǎng)時間、預(yù)培養(yǎng)及分化培養(yǎng)基激素配比對芽分化率的影響。結(jié)果表明：多數(shù)基因型在MS培養(yǎng)基上分化效果優(yōu)于MB培養(yǎng)基；預(yù)培養(yǎng)3 d時外植體芽分化率最高；預(yù)培養(yǎng)基最優(yōu)配比為1.0 mg/L 6?BA + 1.0 mg/L 2,4?D，分化培養(yǎng)基最優(yōu)配比為3.0 mg/L 6?BA + 0.05 mg/L NAA；激素濃度過高易引發(fā)玻璃化、褐化及過量生根，顯著降低分化率。本研究建立了穩(wěn)定高效的甘藍(lán)型油菜子葉與下胚軸再生體系，可為油菜遺傳轉(zhuǎn)化與基因工程育種提供技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：甘藍(lán)型油菜；子葉；下胚軸；組織培養(yǎng)；植株再生；激素配比

中圖分類號：S565.4；Q813.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

引言:油菜（Brassica napus L.）是我國第一大油料作物，菜籽油占國產(chǎn)食用植物油40%左右，在糧油安全與農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整中具有重要戰(zhàn)略地位**[1-2]。甘藍(lán)型油菜因產(chǎn)量高、適應(yīng)性廣、抗逆性強(qiáng)，已成為我國主栽油菜類型。隨著基因編輯與轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展，建立高效穩(wěn)定的離體再生體系是油菜遺傳改良的關(guān)鍵前提。子葉和下胚軸具有取材方便、分化能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是油菜組織培養(yǎng)中應(yīng)用最廣泛的外植體[3-5]**。

目前，不同基因型油菜再生效率差異顯著，激素配比、預(yù)培養(yǎng)條件等仍需優(yōu)化**[6-7]**。本試驗以6個甘藍(lán)型油菜品種為材料，系統(tǒng)研究培養(yǎng)基類型、預(yù)培養(yǎng)時間及植物生長調(diào)節(jié)劑對油菜子葉與下胚軸再生的影響，篩選最優(yōu)培養(yǎng)體系，為油菜高效遺傳轉(zhuǎn)化提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試甘藍(lán)型油菜品種：A2、B2、7、10、16、18，種子由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院董振生教授提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌苗獲得

選取飽滿種子，75%乙醇表面消毒2 min，無菌水沖洗；0.1% HgCl?消毒20 min，無菌水沖洗5次。接種于1/2MS + 1%蔗糖 + 0.6%瓊脂（pH 5.8），暗培養(yǎng)3 d，再轉(zhuǎn)入25±1℃、光照強(qiáng)度2000 Lux、光照16 h/d條件下培養(yǎng)2 d。切取帶1–2 mm子葉柄的子葉，下胚軸切為5–8 mm小段作為外植體。

1.2.2 基本培養(yǎng)基篩選

外植體分別接種于兩種分化培養(yǎng)基：

MS + 3%蔗糖 + 0.6%瓊脂 + 3 mg/L 6?BA + 0.1 mg/L NAA（pH 5.8）

MB + 3%蔗糖 + 0.6%瓊脂 + 3 mg/L 6?BA + 0.1 mg/L NAA（pH 5.8）

30 d后統(tǒng)計芽分化率。

1.2.3 預(yù)培養(yǎng)時間優(yōu)化

以B2為材料，外植體接入預(yù)培養(yǎng)基：MS + 3%蔗糖 + 0.6%瓊脂 + 1 mg/L 6?BA + 1 mg/L 2,4?D（pH 5.8），設(shè)置不同預(yù)培養(yǎng)時間，再轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基：MS + 3%蔗糖 + 0.6%瓊脂 + 3 mg/L 6?BA + 0.05 mg/L NAA（pH 5.8），30 d后統(tǒng)計分化率。

1.2.4 預(yù)培養(yǎng)基激素配比

6?BA設(shè)0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L，2,4?D設(shè)0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L，共16個處理。預(yù)培養(yǎng)3 d后轉(zhuǎn)入上述分化培養(yǎng)基，30 d后統(tǒng)計分化率。

1.2.5 分化培養(yǎng)基激素配比

6?BA設(shè)0.0、1.5、3.0、4.5、6.0 mg/L，NAA設(shè)0.00、0.02、0.05、0.10、0.20 mg/L，共25個處理。30 d后統(tǒng)計分化率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

芽分化率 = 再生芽數(shù) / 接種外植體數(shù) × 100%。每處理3次重復(fù)，采用Excel 2019與SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體分化過程

子葉接種3 d后開始膨大，7 d切口處形成淡綠色致密愈傷組織，10 d出現(xiàn)根點(diǎn)，隨后愈傷轉(zhuǎn)綠并產(chǎn)生綠色芽點(diǎn)，30 d左右形成再生芽。下胚軸接種7 d后膨大，15 d形成白色愈傷，逐漸轉(zhuǎn)綠分化成芽。含6?BA + NAA的培養(yǎng)基愈傷組織偏致密；含6?BA + 2,4?D的愈傷組織較松散、生長旺盛。

2.2 基本培養(yǎng)基對分化的影響

在子葉分化中，品種16在MS與MB上分化率均為100%，其余5個品種在MS培養(yǎng)基上分化率更高。下胚軸分化中，A2在兩種培養(yǎng)基上均為0，其余品種均以MS培養(yǎng)基更優(yōu)。表明MS更適合作為甘藍(lán)型油菜再生基本培養(yǎng)基。

2.3 預(yù)培養(yǎng)時間對分化的影響

預(yù)培養(yǎng)時間顯著影響再生效率。預(yù)培養(yǎng)3 d時芽分化率最高；短于3 d愈傷形成不足；超過4 d愈傷偏松散，轉(zhuǎn)接后易褐化死亡，分化率顯著下降。

2.4 預(yù)培養(yǎng)基激素配比優(yōu)化

6?BA與2,4?D配比對分化影響極顯著。子葉分化率7.41%–57.14%，下胚軸7.14%–64.52%。1.0 mg/L 6?BA + 1.0 mg/L 2,4?D為最佳配比。激素濃度在0.5–1.0 mg/L范圍內(nèi)，分化率隨濃度升高而上升；超過1.0 mg/L則呈下降趨勢。

2.5 分化培養(yǎng)基激素配比優(yōu)化

6?BA與NAA配比顯著影響芽分化。子葉分化率4.00%–62.96%，下胚軸7.14%–68.00%。3.0 mg/L 6?BA + 0.05 mg/L NAA為最優(yōu)組合。6?BA＞3.0 mg/L、NAA＞0.05 mg/L時，玻璃化、畸形苗與過量生根加劇，分化率降低。

3 討論

本研究表明，預(yù)培養(yǎng)3 d可顯著提高油菜外植體再生效率，與前人研究結(jié)果一致**[3,5]。2,4?D對愈傷誘導(dǎo)效果顯著，但濃度＞1.0 mg/L時愈傷過度增殖，不利于芽分化[6-7]**。6?BA是促芽分化的關(guān)鍵激素，但濃度＞4.5 mg/L時玻璃化嚴(yán)重，適宜濃度為1.0–3.0 mg/L。NAA過低易導(dǎo)致大量生根，過高抑制芽分化，0.05 mg/L為最佳濃度。

基因型是影響油菜再生的重要因素，易再生基因型對激素范圍適應(yīng)性更廣**[4,7]**。實際遺傳轉(zhuǎn)化中應(yīng)優(yōu)先選用再生能力強(qiáng)的基因型，并結(jié)合外植體生理狀態(tài)與激素配比進(jìn)一步提升再生頻率。

4 結(jié)論

建立了甘藍(lán)型油菜子葉與下胚軸高效再生體系：

基本培養(yǎng)基以MS為宜；

最佳預(yù)培養(yǎng)時間為3 d；

預(yù)培養(yǎng)基最優(yōu)配比：1.0 mg/L 6?BA + 1.0 mg/L 2,4?D；

分化培養(yǎng)基最優(yōu)配比：3.0 mg/L 6?BA + 0.05 mg/L NAA。

該體系可用于油菜遺傳轉(zhuǎn)化與基因工程育種。

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責(zé)編：劉朋濤

編輯：劉凡